摘要：Teledyne ISCO 分析色譜管在 ACCQPrep® HPLC 系統以簡單的偵查運作即可產生分離方法。此流程不僅能搭配 RediSep® HPLC 色譜管柱，也能搭配 RediSep Gold® 金標快速層析管柱，這意味著使用者可以同時開發閃式快速層析的方法。其他供應商的 C18 色譜管柱也可以用於方法開發，但與 RediSep 色譜管柱相比，選擇性可能稍微存在差異，這意味著出峰時間可能不一定會在預期的時間被洗脫。在本應用報告中描述的方法放大流程是有效的，只需將時間轉換成柱體積，因為一個化合物在某個特定溶劑組份的洗脫時間是特定的。另一種方法是使用 ACCQPrep HP150 使用 RediSep Prep 色譜管柱和內建在系統中的聚焦梯度產生器，從偵測運行中快速建立聚焦梯度 (參考應用報告 AN119)。
實驗儀器和色譜管柱
分析 HPLC 系統和 表 1 中所列的色譜管柱。
如果需要溶劑改良劑，同樣的改良劑需同時應用於高效液相層析儀和閃式快速製備系統，揮發性改良劑在純化後更容易從樣品中移除。
實驗結果和討論
對於閃式快速色譜，苜蓿選洗脫時間約 6 個柱體積 (CV)，當轉換為 CV 單位時，很容易將 uHPLC 梯度從一個色譜柱放大到另一個色譜柱。
三段線性梯度效果很好，第壹段為 12 個CV，目標化合物洗脫在中間，約6個 CV，不管怎樣，起始和結束溶劑組成是洗脫化合物所需要的。由於HPLC系統駐留死體積的原因，沒有必要在運行開始時等度保持，相對於柱體積和 HPLC 駐留死體積的大小，運行 CombiFlash®NextGen梯度時，目標化合物可能提前或稍微滯後被洗脫。加入一個0.01分鐘時長的步驟，然後以100% B清洗層析管中清除殘留化合物。
每段長度(以分鐘為單位)的計算方法是用梯度長度乘以柱體積，然後除以流速。梯度表是透過將分段長度加到前幾次的總和而得到的。在表2中，柱體積中的片段長度被轉換為時間，並將添加的片段長度形成梯度表。
如果方法的分離度可以接受，使用相同的梯度表很容易建立一個閃式快速的梯度，用於以 CV 為單位的 CombiFlash 儀器。
結果
下面顯示的運行使用了 表 2 中所列的梯度片段。一次運行使用 2 × 50 mm C8 色譜管柱，另一次使用 4.6 × 150 mm C18 層析管柱。 Benzophenone 在水/乙腈體系的梯度洗脫。
C8, 2×50 mm 運行實例
在 RediSep Prep C8 2 x 50 mm 色譜柱上發展的方法，3 分鐘內，梯度為 40% – 50% B，然後一步升到 100% B，使用水/乙腈系統清除色譜管柱中的雜質。
化合物洗脫時間為 2 min 或 7.9 CV。然後樣品在 50 g RediSep Rf Gold C8 柱 (PN 69-2203-712) 上運行，使用相同的梯度，和已確定的管柱體積。
閃式快速層析管的洗脫與 uHPLC 柱的洗脫非常接近，顯示該方法可以透過這種方式轉移。
C18, 4.6 x 150 mm 運行實例
在 4.6 × 510mm RediSep Prep C18 色譜管柱上建立了的方法
使用水/乙腈體系，在 18 分鐘內，梯度為 50% – 60% B，然後一步升到 100% B，以從色譜柱中清洗污染物。 C18 比 C8 具有更強的保留能力，因此在柱體積相同的保留時間下，需要更強的溶劑系統才能得到洗脫。
該化合物在 11.9 min 或 7.9 CV 洗脫。將方法轉移到 50 g RediSep Rf Gold C18 色譜管柱 (PN 69-2203-336) 上運行，在水/乙腈體系中。
再一次表明，閃式快速色譜柱與分析用高效液相層析保留有很好的一致性。
值得注意的是，從 uHPLC 層析管轉換的方法在閃式快速層析管洗脫比預測保留時間稍早，而 HPLC 預測的洗脫時間比實際閃式快速層析管洗脫時間稍早。這是因為在計算中沒有考慮系統駐留死體積。
uHPLC 和 HPLC 層析管在同一分析儀器上運行，分析系統駐留死體積相對於 uHPLC 柱較大，但相對於 4.6 mm 層析管柱較小，因此不同運行時間梯度延遲的程度不同。在分析過程中，蕞好使目標化合物的洗脫在梯度的中間，以允許不同儀器之間保留體積一定的變化。
結論
RediSep Prep 色譜管柱可以可靠地用於開發閃式快速層析的方法，2 × 50 mm uHPLC 色譜管柱是非常快速的方法開發手段，運行基本在 5 分鐘內完成。兩種色譜柱都需要極少量的樣品，節省幾乎所有的待純化樣品。
