簡介
細菌內毒素檢測 (BET，Bacterial Endotoxins Testing) 是測量水樣本、原料、腸道外藥物中細菌內毒素污染的必要測定程序。全球藥典協調統一對細菌內毒素檢測有規範性專論，概述了 3 種常用的方法 (即凝膠法、動態濁度法、動態顯色法)。顯色法分為終點法和動態法這兩種形式。在這個研究中，我們同時使用 96 孔板和Sievers® Eclipse 細菌內毒素檢測儀這兩種動態顯色法平台，並比較了它們的檢測時間和結果。
配備孵育吸光度讀數器的 96 孔板是最常用的符合藥典的動態顯色檢測平台。傳統的 96 孔板雖然是眾所周知的可靠的細菌內毒素檢測平台，卻有諸多無法克服的缺點，例如過長的設定時間、重複的移液步驟、代價高昂的出錯幾率。 Sievers® Eclipse 是一款符合藥典的微孔板讀數器，帶有設計獨特的微流體微孔板，預載了內毒素標準品和陽性對照標準品 (PPC，Positive Product Control)，在無需採用機器人技術的情況下實現了內毒素測定的自動化，並且避免了大部分潛在的操作錯誤。
操作程式
同時用 Sievers Eclipse 和 96 孔板來檢測常規水和常規產品，記錄以下操作的時間：
- 準備標準品和樣品
- 設定軟體
- 將標準品和樣品加入微孔板
- 添加陽性對照標準品（PPC）
- 添加鱟試劑
- 測定前的準備時間總計
我們得到了測定結果，並比較了以下參數：陰性對照標準品、R 值、標準品的 %CV、PPC 回收率、PPC 的 %CV。
*CV：Coefficients of Variation，變異係數
此項研究由一位合格的分析員來完成，每種方法的 10 次測定所花費的準備時間一致。分析員同時使用完整的 96 孔板和 Eclipse 微孔板，每次測定時共測量 21 份樣本。在每種方法的 10 次測定中，5 次使用產品，另 5 次僅使用水樣。完成此項研究的分析員擁有豐富的移液操作經驗和 10 年的鱟試劑測試經驗。
檢測結果
表 1：Sievers Eclipse 平台與 96 孔板的偵測時間比較
| Sievers Eclipse (分鐘：秒) | 96孔版 (分鐘：秒) | ||
| 水樣品/產品 | 常規水檢測 | 產品檢測 | |
| 準備標準品合像品 (包含稀釋時間) | 1 : 56 | 12 : 30 | 24 : 42 |
| 設置軟體 | 0 : 22 | 0 : 45 | 0 : 44 |
| 將標準品合樣品添加到微孔板 | 7 : 01 | 17 : 21 | 17 : 56 |
| 添加PPC | 不適用 | 3 : 42 | 3 : 56 |
| 添加鱟試劑 | 0 : 22 | 2 : 22 | 2 : 22 |
| 測定前的準備時間總計 | 9 : 40 | 36 : 40 | 48 : 56 |
表 2：Sievers Eclipse 平台與 96 孔板的 10 次測定結果比較
| Sievers Eclipse* | 96孔版* | |
| 陰性對照標準品 | 未超過LLOQ+10%的啟效 | |
| R值 | 0.999 ± 0.001 | 0.997 ± 0.001 |
| 標準品%CV | 2.83 ± 1.98 | 1.67 ± 2.04 |
| PPC回收率 | 101.9 ± 14.4 | 142.7 ± 24.4 |
| PPC%CV | 1.98 ± 1.76 | 2.13 ± 9.09 |
* 所有的數值均包括常規水和常規產品檢測結果
與 96 孔板相比，Sievers Eclipse 每次測定的平均時間縮短了 27-39 分鐘。平均設定時間因分析員和所運行的特定檢測而異。產品檢測往往需要進行多次稀釋，因此分析員需要較長時間來準備。但水樣檢測可以簡化，所需的準備時間較短。此項研究結果表明，假設分析員每天進行2次常規測定，Sievers Eclipse 平台可使該分析員每年節省約 260 小時或 6.5 週的工作時間（假設分析師一年工作 48 週，一周工作 40 小時）。分析員每年節省近 14% 的時間，可以將省下來的時間用於實驗室和本部門的其它工作。
此外，現今普遍使用的 96 孔板要求進行繁瑣的移液步驟。假設分析員檢測 21 份樣品（即能用96孔板檢測的最多樣品數），如果使用連續移液器（Repeater Pipette），則大約需要進行 242 個移液步驟。如果使用多道移液管（Multi-channel Pipettor）和試劑槽來存放鱟試劑，雖能減少移液步驟，但操作時間仍然太長，而且技術上容易出錯。在同樣情況下如果用 Sievers Eclipse 來檢測 21 份樣品，則只需進行 27 個移液步驟，而且設定時間和得到結果的時間都大大縮短（見下面的 圖 1 和 圖 2）。
Eclipse 還可以非常方便地設定常規檢測和各種研究，其中包括但不限於：
- 低濃度內毒素回收率（LER，Low Endotoxin Recovery）研究
- 樣品保存時間研究
- 抑制/增強篩選研究
- 產品驗證
- 滅菌箱驗證
檢測 21 份樣品時的效率比較
圖 1：Sievers Eclipse 和 96 孔板的連續移液器操作比較
圖 2：Sievers Eclipse 和 96 孔板的多道移液管操作比較
表 1 和 表 2 的結果顯示，Sievers Eclipse 可以產生與 96 孔板相當的結果，但 Eclipse 的手動操作時間大大縮短。 Eclipse 也符合 表 3 所列的全部藥典要求。
| 藥典要求 | Sievers Eclipse* |
| 至少3點標準曲線一式兩份 | V |
| 陰性對照標準品至少一式兩份 | V |
| 樣品至少一式兩份 | V |
| 樣品陽性對照 (PPC) 至少一式兩份 | V |
| 分析員資格驗證標準曲線至少一式三份 | V |
| 使用標準化內毒素 (RSE/CSE) | V |
表 3：藥典要求
結論
Sievers Eclipse 是一款完全合規的內毒素檢測平台，符合 USP <85>、EP 2.6.14、ChP <1143>、JP 4.01 規定的藥典要求。 Sievers Eclipse 採用先進的工具和技術（例如：Sievers Eclipse 微孔板採用先進的微流體技術），使品質控制實驗室不僅大大節省了分析師的操作時間，還減少了潛在的無效檢測幾率，以及重新檢測和撰寫調查報告所耗費的時間。
