目的
美國藥典第 <86> 章允許使用非動物來源的試劑進行細菌內毒素檢測，包括使用重組級聯試劑 (rCR，Recombinant Cascade Reagent) 和重組 C 因子試劑 (rFC，Recombinant Factor C)。本文展示了 Sievers® Eclipse 細菌內毒素 (BET，Bacterial Endotoxins Testing) 檢測儀與 rCR 試劑在化驗各種藥品時的適用性和相容性，為鱟試劑 (LAL，Limulus Amoebocyte Lysate) 細菌內毒素檢測提供了高效、非動物來源的替代方法。
我們對 7 種已發布的市售產品進行了方法適用性和最佳化分析。我們用 Sievers Eclipse 細菌內毒素檢測儀運行了一個批次的市售重組級聯試劑 (rCR)，並比較了同一生產商的動態顯色法鱟試劑。本研究測試的7種市售產品列於 表 1。
表1：用 Eclipse 測試的產品
產品 |
注射用水 |
注射用乳酸林格氏液，USP 級 |
0.9% 氯化鈉液，USP 級 |
5% 葡萄糖注射液，USP 級 |
紅黴素注射液 |
人類胰島素自動注射器 (複合產品)，USP 級 |
氯化鉀注射液 |
背景資訊
Sievers Eclipse 細菌內毒素檢測儀採用動態方法分析標準曲線和最多 21 個帶陽性對照 (PPC，Positive Product Controls) 的樣本。 Sievers Eclipse 微孔板預置來自參考標準內毒素 (RSE，Reference Standard Endotoxin) 的標準品和陽性對照 (PPC)，用戶僅需使用 1 m L的鱟試劑即可運行每次最多5點的標準曲線 (範圍：50 – 0.005 EU/mL) 的化驗。
市售的 rCR 試劑與顯色法試劑類似，具有 LAL 級聯結構。本研究旨在確定這種 rCR 試劑在進行現實生活樣本測試時的表現是否確實與傳統的動態顯色法鱟試劑相似。我們用 Sievers Eclipse 對每種產品分別使用 rCR 試劑和動態顯色法試劑進行測試。
樣品製備和實驗測試計劃
我們透過測試不同稀釋倍數的細菌內毒素檢查用水 (LRW，LAL Reagent Water) 來對全部產品進行初步篩選，以確定哪種稀釋度可以實現最佳 PPC 回收率和克服樣品幹擾。我們分析的稀釋倍數包括1:1、1:10、1:20、1:50、1:100。
表 2 是初步篩選出來的各種試劑類型的品名和稀釋倍數。在測試產品時，我們對胰島素、紅黴素、氯化鉀進行了多種稀釋倍數的測試，以便在完成產品篩選後得到更多的結果並克服樣本幹擾。
標準品和產品的接受標準如下：
- 標準品、樣本、陽性對照 (PPC) 的變異係數百分比 (CV%)：≤ 15%
- PPC 回收率：50-200%
- R 值：≥ -0.980 的絕對值
表 2：產品的稀釋倍數
產品 | 稀釋度 |
氯化鉀注射液 | 1:20、1:50 |
| 紅黴素注射液 | 1:20、1:50 |
5% 葡萄糖注射液，USP 級 | 1:10 |
| 氯化鈉液，USP 級 | 1:20 |
注射用乳酸林格氏液，USP 級 | 1:20 |
| 人類胰島素注射液，USP 級 | 1:10、1:20、1:50 |
注射用水 | 1:1 |
測試結果
測試結果總結如下。表 3 和 表 4 是標準曲線的結果，表 5-10 是樣品的結果。
標準曲線結果
表 3：動態顯色法鱟試劑的 5 點標準曲線結果：使用 Sievers Eclipse 測試
微孔板號 | R值 | %CV 起效時間 ＜ 15% | 陰性對照液 ＞ 0.005 EU/mL |
| 1 | -0.999 | 有效 | 通過 |
2 | -1.000 | 有效 | 通過 |
3 | -1.000 | 有效 | 通過 |
| 4 | -0.998 | 有效 | 通過 |
表 4：重組級聯試劑的 5 點標準曲線結果：使用 Sievers Eclipse 測試
微孔板號 | R值 | %CV 起效時間 ＜ 15% | 陰性對照液 ＞ 0.005 EU/mL |
| 1 | -0.999 | 有效 | 通過 |
2 | -0.999 | 有效 | 通過 |
| 3 | -1.000 | 有效 | 通過 |
4 | -0.999 | 有效 | 通過 |
| 5 | -0.999 | 有效 | 通過 |
樣品結果
氯化鉀
表 5：Sievers Eclipse 測試的氯化鉀液結果 (每個板上有 3 或 5 份重複樣本)
微孔板號 | 試劑/稀釋度 | 平均 PPC 回收率% | 樣品 %CV < 15 | PPC %CV < 15 | 結果 |
| 1 | 動態顯色法鱟試劑 (1:20) x 3 | 107.9 | 有效 | 有效 | < 0.1 EU/mL |
2 | 動態顯色法鱟試劑 (1:20) x 3 | 78.7 | 有效 | 有效 | < 0.1 EU/mL |
| 3 | 動態顯色法鱟試劑 (1:20) x 3 | 91.7 | 有效 | 有效 | < 0.1 EU/mL |
4 | 重組級聯試劑 (1:20) x 3 | 84.9 | 有效 | 有效 | < 0.1 EU/mL |
| 5 | 重組級聯試劑 (1:20) x 3 | 68.6 | 有效 | 有效 | < 0.1 EU/mL |
6 | 重組級聯試劑 (1:20) x 3 | 74.1 | 有效 | 有效 | < 0.1 EU/mL |
| 7 | 重組級聯試劑 (1:20) x 3 | 102.5 | 有效 | 有效 | < 0.25 EU/mL |
8 | 重組級聯試劑 (1:50) x 3 | 101.5 | 有效 | 有效 | < 0.25 EU/mL |
| 9 | 重組級聯試劑 (1:50) x 5 | 97.1 | 有效 | 有效 | < 0.25 EU/mL |
紅黴素
表 6：Sievers Eclipse 測試的紅黴素液結果 (每個板上有 3 或 5 份重複樣本)
微孔板號 | 試劑/稀釋度 | 平均 PPC 回收率 % | 樣品 %CV < 15 | PPC %CV < 15 | 結果 |
1 | 動態顯色法鱟試劑 (1:20) x 3 | 78.3 | 有效 | 有效 | < 0.002 EU/ mg |
| 2 | 動態顯色法鱟試劑 (1:20) x 3 | 83.3 | 有效 | 有效 | < 0.003 EU/ mg |
3 | 動態顯色法鱟試劑 (1:20)* x 3 | 87.7* | 有效* | 有效* | < 0.002 EU/ mg* |
| 4 | 動態顯色法鱟試劑 (1:20) x 3 | 71.3 | 有效 | 有效 | < 0.002 EU/ mg* |
5 | 重組級聯試劑 (1:20) x 3 | 84.6 | 有效 | 有效 | < 0.002 EU/ mg |
| 6 | 重組級聯試劑 (1:20) x 3 | 68.0 | 有效 | 有效 | < 0.002 EU/ mg |
7 | 重組級聯試劑 (1:20) x 3 | 不適用** | 有效** | 有效** | 不適用** |
| 8 | 重組級聯試劑 (1:50) x 3 | 120.4*** | 有效/無效*** | 有效/無效*** | < 0.005 EU/ mg*** |
9 | 重組級聯試劑 (1:50) x 5 | 98.3 | 有效 | 有效 | < 0.002 EU/ mg |
*一個重複樣本有分孔 **所有3個重複樣本中都有分孔 ***一個重複樣本的 %CV > 15
5% 葡萄糖
表 7：Sievers Eclipse 測試的5%葡萄糖液結果 (每個板上有 3 份重複樣本)
微孔板號 | 試劑/稀釋度 | 平均 PPC 回收率 % | 樣品 %CV < 15 | PPC %CV < 15 | 結果 |
1 | 動態顯色法鱟試劑 (1:10) | 123.4 | 有效 | 有效 | < 0.05 EU/ mL |
| 2 | 動態顯色法鱟試劑 (1:10) | 96.4 | 有效 | 有效 | < 0.05 EU/ mL |
3 | 動態顯色法鱟試劑 (1:10) | 102.9 | 有效 | 有效 | < 0.05 EU/ mL |
| 4 | 重組級聯試劑 (1:10) | 80.2 | 有效 | 有效 | < 0.05 EU/ mL |
5 | 重組級聯試劑 (1:10) | 75.2 | 有效 | 有效 | < 0.05 EU/ mL |
| 6 | 重組級聯試劑 (1:10) | 95.6 | 有效 | 有效 | < 0.05 EU/ mL |
0.9% 氯化鈉
表 8：Sievers Eclipse 測試的 0.9% 氯化鈉液結果 (每個板上有 3 份重複樣本)
微孔板號 | 試劑/稀釋度 | 平均 PPC 回收率 % | 樣品 %CV < 15 | PPC %CV < 15 | 結果 |
1 | 動態顯色法鱟試劑 (1:20) | 134.2 | 有效 | 有效 | < 0.1 EU/ mL |
| 2 | 動態顯色法鱟試劑 (1:20) | 101.5 | 有效 | 有效 | < 0.1 EU/ mL |
3 | 動態顯色法鱟試劑 (1:20) | 115.7 | 有效 | 有效 | < 0.1 EU/ mL |
| 4 | 重組級聯試劑 (1:20) | 111.5 | 有效 | 有效 | < 0.1 EU/ mL |
5 | 重組級聯試劑 (1:20) | 86.7 | 有效 | 有效 | < 0.1 EU/ mL |
| 6 | 重組級聯試劑 (1:20) | 84.5 | 有效 | 有效 | < 0.1 EU/ mL |
乳酸林格氏液
表 9：Sievers Eclipse 測試的乳酸林格氏液結果 (每個板上有 3 份重複樣本)
微孔板號 | 試劑/稀釋度 | 平均 PPC 回收率 % | 樣品 %CV < 15 | PPC %CV < 15 | 結果 |
1 | 動態顯色法鱟試劑 (1:20) | 143.9 | 有效 | 有效 | < 0.1 EU/ mL |
| 2 | 動態顯色法鱟試劑 (1:20) | 122.8 | 有效 | 有效 | < 0.1 EU/ mL |
3 | 動態顯色法鱟試劑 (1:20) | 139.2 | 有效 | 有效 | < 0.1 EU/ mL |
| 4 | 重組級聯試劑 (1:20) | 104.3 | 有效 | 有效 | < 0.1 EU/ mL |
5 | 重組級聯試劑 (1:20) | 94.9 | 有效 | 有效 | < 0.1 EU/ mL |
6 | 重組級聯試劑 (1:20) | 93.5 | 有效 | 有效 | < 0.1 EU/ mL |
人類胰島素注射液
表 10：Sievers Eclipse 測試的人類胰島素注射液結果 (連續編號的板上有 3、5 或 6 份重複樣本)
微孔板號 | 試劑/稀釋度 | 平均PPC回收率% | 樣品 %CV < 15 | PPC %CV < 15 | 結果 |
| 1 | 動態顯色法鱟試劑 (1:10) x 5 | 104.3 | 0.4 – 0.7 | 有效 | < 0.05 EU/ mL |
2 | 動態顯色法鱟試劑 (1:10) x 5 | 87.0* | 有效* | 有效* | < 0.05 EU/ mL* |
| 3 | 重組級聯試劑 (1:10) x 3 | 52.4 | 有效 | 有效 | < 0.05 EU/ mL |
4 | 重組級聯試劑 (1:20) x 3 | 55.6* | 有效* | 有效* | < 0.1 EU/ mL* |
| 5 | 重組級聯試劑 (1:50) x 3 | 101.2 | 有效 | 有效 | < 0.25 EU/ mL |
6 | 重組級聯試劑 (1:50) x 5 | 79.3 | 有效 | 有效 | < 0.25 EU/ mL |
* 一個重複樣本有分孔
注射用水
表 11：Sievers Eclipse 測試的注射用水結果 (每個板上有 3 份重複樣本)
微孔板號 | 試劑/稀釋度 | 平均PPC回收率% | 樣品 %CV < 15 | PPC %CV < 15 | 結果 |
| 1 | 動態顯色法鱟試劑 (1:1) | 120.4 | 有效 | 有效 | < 0.005 EU/ mL |
2 | 重組級聯試劑 (1:1) | 110.2 | 有效 | 有效 | < 0.005 EU/ mL |
| 3 | 重組級聯試劑 (1:1) | 114.1 | 有效 | 有效 | < 0.005 EU/ mL |
結論和建議
對於本研究中的大多數現實生活樣本類型來說，Sievers Eclipse 與市售的重組級聯試劑有極佳的適用性和相容性。紅黴素和胰島素樣本均有多個分孔，很可能是因為樣本幹擾。如果實驗室考慮使用非動物來源的試劑進行符合 USP <86> 標準的細菌內毒素檢測，則可以使用 Sievers Eclipse 微孔板來優化 rCR 試劑。
為了方便日後分析，在比較 rCR 試劑和鱟試劑時，必須進行樣本篩選以確定每種產品的最佳稀釋倍數。當有更多批次的市售試劑可用時，也應對其進行測試以確認結果的準確度和可重複性。
