近年來，在品質控制檢測方面，製藥技術有了重大改進和進步。其中一項檢測是鱟試劑檢測水和最終藥品中的細菌內毒素，內毒素是一種有害的熱原。傳統的光度法鱟試劑檢測 —— 包括用於動態濁度法和動態顯色法的 96 孔板檢測 —— 耗時且需要大量手動時間。現在，透過使用微流控技術，可以顯著減少液體處理和手動時間，同時減少鱟試劑和樣品量，並保證合規性。
合規化驗需要多少鱟試劑？
傳統的鱟試劑檢測使用 96 孔板，每個孔具有特定的形狀和吸光度的路徑長度。 96 孔板的路徑長度依製造商或廠商略有不同。這是因為平底 96 孔板上的孔通常是截頭圓錐體，以便從模具中脫模。 ¹
由於孔的深度和形狀，鱟試劑製造商規定了每個孔需要多少樣品量和鱟試劑，以保持內毒素檢測的 1 : 1 比例。動力學內毒素測定依賴光密度（OD）變化和內毒素濃度之間的反比關係。 OD 是「用分光光度計測定的有機分子懸浮液或溶液在特定波長下吸收的光量」。²
樣本與鱟試劑的比例（1 : 1）非常重要。大多數鱟試劑製造商建議 96 孔板讀數器和試管讀取器使用 100 µL 樣品至 100 µL 鱟試劑。有些鱟試劑使用的樣品和鱟試劑少於 100 µL，這些鱟試劑通常在具有較小孔的微孔板中運行。然而，1 : 1 的比例仍然保持不變。多年來，已證明這種 1 : 1 的比例可以準確地得出內毒素結果。使用 100 µL 的樣品和鱟試劑不是法規或藥典的要求。相反，它是根據孔板或試管讀取器的孔徑大小、所需的路徑長度和達到光密度的吸光度，給出使用多少體積（樣品和鱟試劑）才能達到 1 : 1 比例的一項建議。
微流控技術可以使用較小的反應體積進行準確、可靠且合規的內毒素檢測
近年來，鱟試劑檢測出現了新的創新，如 Sievers® Eclipse 細菌內毒素檢測儀。 Eclipse 利用微流控技術和向心力將小體積的液體準確地輸送到微孔板上的特定部分，從而大大減少了所需的試劑量並簡化了設定。 30 多年來，微流控一直是一個蓬勃發展的研究領域，因為它能夠滿足準確、經濟高效、可靠和靈敏的化學和生物分析需求，而這正是內毒素分析所需要的。
向心微流控用於鱟試劑測試
是 | 否 |
| 符合全球藥典 | 改變內毒素檢測的生物化學 |
| 大幅提高易用性 | 需要大量的設置時間或複雜的移液 |
| 減少動手時間/移液 | 需要標準曲線或PPC製備 |
| 減少培訓量 | 需要複雜的設備或大量的空間 |
| 減少環境汙染 | 需要複雜的驗證 |
| 以1:1的樣品與鱟試劑比例精確測定和分配液體 | 需要大量培訓 |
| 減少鱟試劑、鱟試劑水(LRW)和樣品量 | 需要深入維護 |
| 使用市售鱟試劑 | 需要由化驗人員隨時監測 |
| 支持擴容 |
Eclipse 微孔板在五個區域中嵌入了不同濃度的標準品可製成標準曲線，每個濃度的標準品都有陰性對照。有 21 個樣品區使用者可以在一個板上運行多達 21 個樣品，類似於 96 孔板讀取器。每個樣本區都含有陽性產品對照的內毒素。
由於微流體需要較小的反應體積，但不會改變生物化學結構和特性，因此，將 Eclipse 微流控技術設計為使用比典型方法更少的鱟試劑，同時確保完全合規性。 Eclipse 的光密度是用比爾定律計算出來的。比爾定律，也稱為比爾-朗伯定律，指出「化學溶液的濃度與其對光的吸收成正比。」³ 由於微流體的性質，包括流體通道和樣品/鱟試劑室，Eclipse 只需要 1 mL 鱟試劑，並確保每次測定的樣品與鱟試劑比例為 1 : 1。
確保 Sievers Eclipse 的效能與傳統的微孔板讀取器相當
在 Eclipse 的整個開發過程中進行了廣泛的測試，以確保與 96 孔板讀取器的性能相當。 《美國藥典》在 <1225> 一章中概述了驗證分析方法時需要考慮的參數。 Eclipse 的系統性能是透過測定 USP <1225> 中列出的不同參數來評估的。
表1 USP<1225> 標準和Sievers Eclipse | |
| 驗證參數 | Sievers Eclipse |
準確性 | V |
精確度 | V |
線性 | V |
| 檢測限(LOD) | V |
上限 | V |
特異性 | V |
系統適用性 | V |
等效於 96 孔板 | V |
| 孔均勻性 | V |
背景污染 | V |
| 1 : 1 比例驗證(穩健性) | V |
多年來，Sievers 分析儀對多家廠商的多個鱟試劑批次進行了測試。除了鱟試劑水外，我們還在 Eclipse 和 96 孔板讀取器上運行了藥品樣本。數據顯示，Eclipse 的效能與傳統的微孔板讀取器相當。總結即為，Eclipse 使用符合藥典的動態顯色鱟試劑進行合規的細菌內毒素檢測。根據 USP <1225> 的驗證數據表明，Eclipse 相當於 96 孔板讀取器。
原文英文版刊登於《American Pharmaceutical Review》2023年5-6月刊，本文有所修改。
參考文獻
Sievers Analytical Instruments. Determining equivalent onset optical density (OD) values on the Sievers Eclipse BET platform.
McCullough, Karen Zink. The Bacterial Endotoxins Test: A Practical Approach. DHI Publishing, LLC, 2011.
Helmenstine, Anne Marie. Beer’s Law Definition and Equation. Thought Co, 2019. https:// www.thoughtco.com/beers-law-definition-and-equation-608172
