概要：本文介紹了使用反相 RediSep® 管柱進行勝肽分離的有效方法。透過選擇合適的柱子和初始條件、優化移動相和檢測波長、添加反離子以及建立合適的梯度，可以實現高效的勝肽分離。文章也提供了具體的操作技巧和參數調整建議，以幫助研究人員在生物化學研究中提升勝肽分離的效率和效果。
一、應用概述
肽可以被定義為氨基酸的短鏈聚合物。單一勝肽的特性當然取決於其特定的胺基酸組成和排列方式。肽具有相對的極性，其結合特性與其他蛋白質相當一致。
勝肽混合物可以被分離成單一勝肽種類。如果可以將這些單獨且更具體的勝肽包含在一個單一的餾分中，這將極大地加速許多科學過程。
以下是一個通用的方法，用於在可重複使用的反相 RediSep® C18 柱上將勝肽混合物分離成餾分。
通常好從 4.3 克的 RediSep 反相柱開始。在探索特定勝肽的良好參數時，會使用較少的勝肽樣品和溶劑。一旦確定了洗脫參數，就可以根據需要擴大製程規模。回顧反相理論的應用說明 AN10 可能是有益的。
對於本參考文獻中所使用的特定勝肽混合物，參數列於 表 1 中。參數將隨勝肽結構而變化。
表 1. 通用方法參數
二、通用方法波長
理想的波長會根據勝肽的結構而改變。選擇具有高靈敏度的波長是理想的，同時避免引入過多雜訊或遺漏某些化合物。如果 210 nm 過於吵雜，那麼 214 nm 通常會提供一個更乾淨的基線。環狀結構在 280 nm 處吸收良好，雙鍵在 254 nm 處，單鍵在 210 nm 處。建議的通用波長對於蛋白質和勝肽是 210 nm。
反離子
為了提高勝肽和柱的性能，通常使用反荷離子。這有助於提供更均勻的分離，從而改善柱性能。常用的反荷離子是 0.1% (體積比) 三氟乙酉夋 (TFA)。將其等量添加到 A 和 B 移動相中。在整個分離過程中保持穩定反荷離子濃度會得到更一致的基線。簡單的配製方法是每公升移動相中加入 1 毫升 (0.1% v/v)。直接用移液管將TFA加入移動相中並切底混合。
柱負載
這個參數根據勝肽的組成有很大的變化。對於 4.3 克的 RediSep 反相柱，0.5 毫克應該是個好的起點。
柱構造
柱本身由三個主要部分組成：
- 支持介質是固定相所綁定的固體表面。
- 固定相是附著在支持介質上的活性塗層，即 C18。
- 移動相是流過支持介質的流體，以便將勝肽的活性部分暴露給固定相。
移動相或溶劑系統
許多勝肽強烈地吸附在 C18 上，通常需要一個強梯度來洗脫。典型地，水用作溶劑 A，乙腈用作溶劑 B 來洗脫勝肽。
梯度
在建立新方法時，通常建議創建一個從 0 – 95% B 溶劑的非常緩慢的梯度，以確保所有峰值都被洗脫並且柱子被清潔。
在初始的 0 – 95% 梯度運行後，洗脫輪廓大致確定，可以根據特定勝肽的需要修改梯度。透過在特定的保留時間改變梯度的斜率，可以優化分離時間和峰形。
三、分析結果
圖 1 提供了一個參考勝肽的色譜圖。特定的勝肽是使用 表 1 中列出的參數進行分離的。參數將隨著勝肽的結構而改變。
圖 1. 樣品勝肽色譜圖
四、總結
勝肽的純化方法可以先在較小的柱上建立，然後根據所需的樣品負載量進行放大。
